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蔗糖富集環境中蔗糖磷酸化酶的酶學性質研究與改造
關鍵詞：蔗糖磷酸化酶 酶學性質 分子改造 轉糖苷
摘要：【背景】蔗糖富集土壤是蔗糖磷酸化酶的重要來源之一。此酶能以較廉價的蔗糖為底物進行轉葡萄糖基反應,改善受體底物的理化性質,因而具有重要的應用價值。【目的】研究蔗糖富集土壤中蔗糖磷酸化酶的酶學性質和轉糖苷活性,為其更優質的改造提供材料和理論基礎。【方法】將宏基因組中獲得的蔗糖磷酸化酶基因克隆到表達載體上構建重組大腸桿菌,誘導表達并進行鎳親和層析純化蛋白。以蔗糖為底物測量重組酶的基本酶學性質,研究其對糖類底物的轉糖苷活性。通過底物通道分析,利用反向PCR技術對其第155位點進行飽和突變,并測定突變體基本酶學性質和轉糖苷活性。【結果】純化的酶蛋白分子量大小約為56 kD,活性狀態時以三聚體形式存在。在以蔗糖為底物時,最適溫度和最適pH值分別為55°C和6.5;Km和Vmax值分別為23.1±2.4 mmol/L和407.9±8.5μmol/(mg·min),對第155位點進行了定點飽和突變,獲得了部分酶學性質或轉糖苷活性改善的突變體。【結論】宏基因組中蔗糖磷酸化酶的研究豐富了酶學數據,并通過分子改造獲得了部分性質更優的突變體,為轉糖苷活性關鍵氨基酸的研究和該酶的工業應用奠定了基礎。
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